вести

У последњој деценији, технологија секвенцирања гена се широко користи у истраживању рака и клиничкој пракси, постајући важан алат за откривање молекуларних карактеристика рака. Напредак у молекуларној дијагностици и циљаној терапији подстакао је развој концепата прецизне терапије тумора и донео велике промене у целокупну област дијагнозе и лечења тумора. Генетско тестирање може се користити за упозоравање на ризик од рака, вођење одлука о лечењу и процену прогнозе, и важан је алат за побољшање клиничких исхода пацијената. Овде сумирамо недавно објављене чланке у CA Cancer J Clin, JCO, Ann Oncol и другим часописима како бисмо прегледали примену генетског тестирања у дијагнози и лечењу рака.

Соматске мутације и мутације герминативне линије. Генерално, рак је узрокован мутацијама ДНК које се могу наследити од родитеља (мутације герминативне линије) или стећи са годинама (соматске мутације). Мутације герминативне линије су присутне од рођења, а мутатор обично носи мутацију у ДНК сваке ћелије у телу и може се пренети на потомство. Соматске мутације појединци стичу у негаметним ћелијама и обично се не преносе на потомство. И мутације герминативне линије и соматске мутације могу уништити нормалну функционалну активност ћелија и довести до малигне трансформације ћелија. Соматске мутације су кључни покретач малигнитета и најпредиктивнији биомаркер у онкологији; међутим, приближно 10 до 20 процената пацијената са тумором носи мутације герминативне линије које значајно повећавају ризик од рака, а неке од ових мутација су такође терапеутске.
Мутација возача и мутација путника. Нису све варијанте ДНК утицале на функцију ћелија; у просеку је потребно пет до десет геномских догађаја, познатих као „мутације возача“, да би се покренула нормална дегенерација ћелија. Мутације возача се често јављају у генима који су блиско повезани са животним активностима ћелија, као што су гени укључени у регулацију раста ћелија, поправку ДНК, контролу ћелијског циклуса и друге животне процесе, и имају потенцијал да се користе као терапијске мете. Међутим, укупан број мутација у било ком раку је прилично велики, у распону од неколико хиљада код неких карцинома дојке до више од 100.000 код неких веома варијабилних колоректалних и ендометријалних карцинома. Већина мутација нема или има ограничен биолошки значај, чак и ако се мутација догоди у кодирајућем региону, такви безначајни мутациони догађаји називају се „мутације путника“. Ако варијанта гена у одређеном типу тумора предвиђа његов одговор на лечење или отпорност на лечење, варијанта се сматра клинички оперативном.
Онкогени и гени супресора тумора. Гени који често мутирају код рака могу се грубо поделити у две категорије, онкогене и гене супресора тумора. У нормалним ћелијама, протеин који кодирају онкогени углавном игра улогу у промоцији ћелијске пролиферације и инхибирању апоптозе ћелија, док је протеин који кодирају онкосупресорски гени углавном одговоран за негативну регулацију ћелијске деобе како би се одржала нормална функција ћелија. У процесу малигне трансформације, геномска мутација доводи до повећања активности онкогена и смањења или губитка активности онкосупресорских гена.
Мала варијација и структурна варијација. Ово су два главна типа мутација у геному. Мале варијанте мењају ДНК променом, брисањем или додавањем малог броја база, укључујући уметање база, делецију, померање оквира читања, губитак старт кодона, губитак стоп кодона итд. Структурна варијација је велико преуређење генома, које укључује сегменте гена величине од неколико хиљада база до већине хромозома, укључујући промене броја копија гена, делецију хромозома, дупликацију, инверзију или транслокацију. Ове мутације могу изазвати смањење или побољшање функције протеина. Поред промена на нивоу појединачних гена, геномски потписи су такође део извештаја о клиничком секвенцирању. Геномски потписи се могу посматрати као сложени обрасци малих и/или структурних варијација, укључујући оптерећење туморским мутацијама (TMB), микросателитску нестабилност (MSI) и дефекте хомологне рекомбинације.

Клоналне мутације и субклоналне мутације. Клонске мутације су присутне у свим туморским ћелијама, присутне су при дијагнози и остају присутне након напретка лечења. Стога, клоналне мутације имају потенцијал да се користе као терапијске мете тумора. Субклоналне мутације су присутне само у подскупу ћелија рака и могу се открити на почетку дијагнозе, али нестају са накнадним рецидивом или се појављују тек након лечења. Хетерогеност рака односи се на присуство вишеструких субклоналних мутација у једном раку. Приметно је да су велика већина клинички значајних покретачких мутација код свих уобичајених врста рака клоналне мутације и остају стабилне током прогресије рака. Резистенција, која је често посредована субклоновима, можда се не открива у време дијагнозе, али се појављује када се рак врати у нормалу након лечења.

Традиционална техника FISH или ћелијски кариотип користи се за откривање промена на хромозомском нивоу. FISH се може користити за откривање генских фузија, делеција и амплификација и сматра се „златним стандардом“ за откривање таквих варијанти, са високом тачношћу и осетљивошћу, али ограниченим пропусним капацитетом. Код неких хематолошких малигнитета, посебно акутне леукемије, кариотипизација се и даље користи за вођење дијагнозе и прогнозе, али ову технику постепено замењују циљани молекуларни тестови као што су FISH, WGS и NGS.
Промене у појединачним генима могу се детектовати ПЦР-ом, како у реалном времену, тако и дигиталном капљичном ПЦР-ом. Ове технике имају високу осетљивост, посебно су погодне за детекцију и праћење малих резидуалних лезија и могу добити резултате у релативно кратком времену. Мана је што је опсег детекције ограничен (обично детектују само мутације у једном или неколико гена), а могућност вишеструких тестова је ограничена.
Имунохистохемија (IHC) је алат за праћење заснован на протеинима који се обично користи за детекцију експресије биомаркера као што су ERBB2 (HER2) и рецептори естрогена. IHC се такође може користити за детекцију специфичних мутираних протеина (као што је BRAF V600E) и специфичних генских фузија (као што су ALK фузије). Предност IHC је што се може лако интегрисати у рутински процес анализе ткива, тако да се може комбиновати са другим тестовима. Поред тога, IHC може пружити информације о субћелијској локализацији протеина. Мане су ограничена скалабилност и високи организациони захтеви.
Секвенцирање друге генерације (NGS) NGS користи технике паралелног секвенцирања високог протока за детекцију варијација на нивоу ДНК и/или РНК. Ова техника се може користити за секвенцирање и целог генома (WGS) и генских региона од интереса. WGS пружа најсвеобухватније информације о геномским мутацијама, али постоје многе препреке за његову клиничку примену, укључујући потребу за свежим узорцима туморског ткива (WGS још увек није погодан за анализу узорака имобилизованих формалином) и високу цену.
Циљано NGS секвенцирање укључује секвенцирање целог ексона и панел циљног гена. Ови тестови обогаћују регионе од интереса ДНК сондама или PCR амплификацијом, чиме се ограничава потребна количина секвенцирања (цео ексом чини 1 до 2 процента генома, а чак и велики панели који садрже 500 гена чине само 0,1 проценат генома). Иако секвенцирање целог ексона добро функционише у ткивима фиксираним формалином, његова цена остаје висока. Комбинације циљних гена су релативно економичне и омогућавају флексибилност у одабиру гена који се тестирају. Поред тога, циркулишућа слободна ДНК (cfDNA) се појављује као нова опција за геномску анализу пацијената оболелих од рака, позната као течне биопсије. И ћелије рака и нормалне ћелије могу да ослободе ДНК у крвоток, а ДНК излучена из ћелија рака назива се циркулишућа туморска ДНК (ctDNA), која се може анализирати да би се откриле потенцијалне мутације у туморским ћелијама.
Избор теста зависи од специфичног клиничког проблема који треба решити. Већина биомаркера повезаних са одобреним терапијама може се детектовати FISH, IHC и PCR техникама. Ове методе су разумне за детекцију малих количина биомаркера, али не побољшавају ефикасност детекције са повећањем протока, а ако се детектује превише биомаркера, можда неће бити довољно ткива за детекцију. Код неких специфичних карцинома, као што је рак плућа, где је тешко добити узорке ткива и постоји више биомаркера за тестирање, коришћење NGS је бољи избор. Закључно, избор теста зависи од броја биомаркера који се тестирају за сваког пацијента и броја пацијената који се тестирају на биомаркер. У неким случајевима, употреба IHC/FISH је довољна, посебно када је циљ идентификован, као што је детекција рецептора естрогена, рецептора прогестерона и ERBB2 код пацијената са раком дојке. Ако је потребно свеобухватније истраживање геномских мутација и потрага за потенцијалним терапијским циљевима, NGS је организованији и исплативији. Поред тога, NGS се може размотрити у случајевима када су резултати IHC/FISH двосмислени или неубедљиви.

Различите смернице дају смернице о томе који пацијенти треба да испуњавају услове за генетско тестирање. Године 2020, ESMO радна група за прецизну медицину издала је прве препоруке за NGS тестирање за пацијенте са узнапредовалим раком, препоручујући рутинско NGS тестирање за узнапредовали несквамозни неситноћелијски карцином плућа, рак простате, колоректални карцином, рак жучних канала и узорке тумора рака јајника, а 2024. године ESMO је ажурирао препоруке на основу тога, препоручујући укључивање рака дојке и ретких тумора. Као што су гастроинтестинални стромални тумори, саркоми, карциноми штитне жлезде и карциноми непознатог порекла.
У 2022. години, ASCO-ово Клиничко мишљење о тестирању соматског генома код пацијената са метастатским или узнапредовалим раком наводи да ако је терапија повезана са биомаркером одобрена код пацијената са метастатским или узнапредовалим солидним туморима, за ове пацијенте се препоручује генетско тестирање. На пример, геномско тестирање треба извршити код пацијената са метастатским меланомом ради скрининга на мутације BRAF V600E, јер су RAF и MEK инхибитори одобрени за ову индикацију. Поред тога, генетско тестирање треба извршити и ако постоји јасан маркер резистенције на лек који ће се применити пацијенту. Егфрмаб, на пример, је неефикасан код колоректалног карцинома са мутацијом KRAS. Приликом разматрања погодности пацијента за секвенцирање гена, треба интегрисати физичко стање пацијента, коморбидитете и стадијум тумора, јер низ корака потребних за секвенцирање генома, укључујући сагласност пацијента, лабораторијску обраду и анализу резултата секвенцирања, захтева да пацијент има одговарајући физички капацитет и очекивани животни век.
Поред соматских мутација, неке врсте рака треба тестирати и на гене герминативне линије. Тестирање на мутације герминативне линије може утицати на одлуке о лечењу карцинома као што су мутације BRCA1 и BRCA2 код рака дојке, јајника, простате и панкреаса. Мутације герминативне линије такође могу имати импликације на будући скрининг и превенцију рака код пацијената. Пацијенти који су потенцијално погодни за тестирање на мутације герминативне линије морају да испуњавају одређене услове, који укључују факторе као што су породична историја рака, старост при дијагнози и врста рака. Међутим, многи пацијенти (до 50%) који носе патогене мутације у герминативној линији не испуњавају традиционалне критеријуме за тестирање на мутације герминативне линије на основу породичне историје. Стога, како би се максимизирала идентификација носилаца мутација, Национална свеобухватна мрежа за рак (NCCN) препоручује да се сви или већина пацијената са раком дојке, јајника, ендометријума, панкреаса, колоректалног рака или простате тестирају на мутације герминативне линије.
Што се тиче времена генетског тестирања, с обзиром на то да је велика већина клинички значајних покретачких мутација клонална и релативно стабилна током прогресије рака, разумно је извршити генетско тестирање код пацијената у време дијагнозе узнапредовалог рака. За накнадно генетско тестирање, посебно након молекуларно циљане терапије, тестирање цтДНК је повољније од ДНК туморског ткива, јер ДНК крви може да садржи ДНК из свих туморских лезија, што је погодније за добијање информација о хетерогености тумора.
Анализа цтДНК након лечења може предвидети одговор тумора на лечење и идентификовати прогресију болести раније него стандардне методе снимања. Међутим, протоколи за коришћење ових података за вођење одлука о лечењу нису утврђени, а анализа цтДНК се не препоручује осим у клиничким испитивањима. цтДНК се такође може користити за процену малих резидуалних лезија након радикалне операције тумора. Тестирање цтДНК након операције је снажан предиктор накнадне прогресије болести и може помоћи у одређивању да ли ће пацијент имати користи од адјувантне хемотерапије, али се и даље не препоручује употреба цтДНК ван клиничких испитивања за вођење одлука о адјувантној хемотерапији.

Обрада података Први корак у секвенцирању генома је екстракција ДНК из узорака пацијената, припрема библиотека и генерисање сирових података секвенцирања. Сирови подаци захтевају даљу обраду, укључујући филтрирање података ниског квалитета, поређење са референтним геномом, идентификацију различитих врста мутација путем различитих аналитичких алгоритама, одређивање ефекта ових мутација на транслацију протеина и филтрирање мутација герминативне линије.
Анотација гена возача је дизајнирана да разликује мутације возача и путника. Мутације возача доводе до губитка или појачања активности гена супресора тумора. Мале варијанте које доводе до инактивације гена супресора тумора укључују бесмислене мутације, мутације померања оквира читања и мутације кључног места сплајсинга, као и ређе делеције старт кодона, делеције стоп кодона и широк спектар мутација инсерције/делеције интрона. Поред тога, мисенс мутације и мале мутације инсерције/делеције интрона такође могу довести до губитка активности гена супресора тумора када утичу на важне функционалне домене. Структурне варијанте које доводе до губитка активности гена супресора тумора укључују делимичну или потпуну делецију гена и друге геномске варијанте које доводе до уништења оквира за читање гена. Мале варијанте које доводе до побољшане функције онкогена укључују мисенс мутације и повремене инсерције/делеције интрона које циљају важне функционалне домене протеина. У ретким случајевима, скраћивање протеина или мутације места сплајсинга могу довести до активације онкогена. Структурне варијације које доводе до активације онкогена укључују фузију гена, делецију гена и дупликацију гена.
Клиничка интерпретација геномских варијација процењује клинички значај идентификованих мутација, односно њихову потенцијалну дијагностичку, прогностичку или терапеутску вредност. Постоји неколико система оцењивања заснованих на доказима који се могу користити за вођење клиничке интерпретације геномских варијација.
База података о прецизној медицини онкологије (OncoKB) Меморијалног центра за рак Слоун-Кетеринг класификује варијанте гена у четири нивоа на основу њихове предиктивне вредности за употребу лекова: ниво 1/2, биомаркери одобрени од стране ФДА или клинички стандардни биомаркери који предвиђају одговор одређене индикације на одобрени лек; ниво 3, биомаркери одобрени или неодобрени од стране ФДА који предвиђају одговор на нове циљане лекове који су показали обећање у клиничким испитивањима, и ниво 4, биомаркери које није одобрила ФДА и који предвиђају одговор на нове циљане лекове који су показали убедљиве биолошке доказе у клиничким испитивањима. Додата је пета подгрупа повезана са резистенцијом на лечење.
Смернице Америчког друштва за молекуларну патологију (AMP)/Америчког друштва за клиничку онкологију (ASCO)/Колегијума америчких патолога (CAP) за тумачење соматских варијација деле соматске варијације у четири категорије: Степен I, са јаким клиничким значајем; Степен II, са потенцијалним клиничким значајем; Степен III, клинички значај непознат; Степен IV, за који се не зна да ли је клинички значајан. Само варијанте степена I и II су вредне за одлуке о лечењу.
ESMO-ова скала клиничке операбилности молекуларних циљева (ESCAT) класификује варијанте гена у шест нивоа: Ниво I, циљеви погодни за рутинску употребу; Фаза II, циљ који се још увек проучава, вероватно ће се користити за скрининг популације пацијената који би могли имати користи од циљаног лека, али је потребно више података који би то поткрепили. Степен III, циљане варијанте гена које су показале клиничку корист код других врста рака; Степен IV, само циљане варијанте гена поткрепљене преклиничким доказима; У степену V, постоје докази који подржавају клинички значај циљања мутације, али терапија једним леком против циља не продужава преживљавање или се може усвојити стратегија комбинованог лечења; Степен X, недостатак клиничке вредности.